Phenotypic and molecular characterization of erythromycin resistance in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli strains isolated from swine and broiler chickens / Caracterização fenotípica e molecular da resistência à eritromicina em cepas de Campylobacter jejuni e Campylobacter coli isoladas de suínos e frangos de corte

Campylobacter spp. is a bacterial agent that causes gastroenteritis in humans and may trigger Guillain-Barré Syndrome (GBS) and is also considered one of the main foodborne diseases in developed countries. Poultry and pigs are considered reservoirs of these microorganisms, as well as raw or undercooked by-products are often incriminated as a source of human infection. Treatment in human cases is with macrolide, such erythromycin, that inhibits the protein synthesis of the microorganism. This study aimed to isolate Campylobacter jejuni and Campylobacter coli from intestinal content samples of broiler chickens (n=20) and swine (n=30) to characterize the erythromycin resistance profile of the strains and to detect molecular mechanisms involved in this resistance. The minimum inhibitory concentration was determined by agar dilution. The Mismatch Amplification Mutation Assay-Polymerase Chain Reaction (MAMA-PCR) was performed to detect mutations at positions 2074 and 2075 of 23S rRNA region, in addition to PCR test to detect the erm(B) gene. From the intestinal content of broiler chickens, 18 strains of C. jejuni and two strains of C. coli were isolated, whereas, from swine samples, no C. jejuni strain and 14 strains of C. coli were isolated. All C. coli strains were resistant, and three C. jejuni strains from broilers chickens were characterized with intermediate resistance to erythromycin. The MIC of the strains ranged from ≤0.5mg/μL to ≥128mg/μL. All resistant strains had the A2075G mutation, and one strain with intermediate resistance had the A2075G mutation. However, the A2074C mutation and the erm(B) gene were not detected. High resistance levels were detected in C. coli strains isolated from swine. The MAMA-PCR is a practical tool for detecting the erythromycin resistance in Campylobacter strains.(AU)

Campylobacter spp. é um agente bacteriano causador de gastroenterite em humanos e associado à síndrome de Guillain-Barré, sendo a campilobacteriose considerada uma das principais enfermidades de origem alimentar. Aves e suínos são importantes reservatórios desses microrganismos e seus produtos derivados crus ou mal cozidos são muitas vezes incriminados como fonte de infecção humana. A primeira escolha para o tratamento em casos humanos são os antimicrobianos da classe dos macrolídeos como à eritromicina. Dentro desse contexto, o objetivo deste estudo foi isolar Campylobacter jejuni e C. coli a partir de 20 amostras de conteúdo intestinal de frangos de corte e de 30 de suínos ao abate e investigar a resistência à eritromicina das estirpes obtidas e os possíveis mecanismos moleculares envolvidos nesta resistência. A concentração inibitória mínima foi determinada pela diluição em ágar e a técnica MAMA-PCR foi utilizada para detecção de mutações nas posições 2074 e 2075 da região 23s rRNA, foi pesquisado também a presença do gene erm(B) pela PCR. A partir do conteúdo intestinal de frangos de corte foram isoladas 18 estirpes de C. jejuni e duas de C. coli, enquanto de suínos foram obtidas 14 estirpes de C. coli e nenhuma estirpe de C. jejuni. Todas as estirpes de C. coli de suínos foram identificadas como resistentes e três estirpes de C. jejuni de frangos foram caracterizadas com resistência intermediária. A CIM das estirpes variou de ≤0,5mg/μL a ≥128mg/μL. Todas as estirpes resistentes tinham a mutação A2075G e uma cepa com resistência intermediária também apresentou a mutação A2075G. Não foi detectada a mutação A2074C ou a presença do gene erm(B) em nenhuma das estirpes obtidas. Os resultados revelam um alto nível de resistência em estirpes de C. coli isoladas de suínos frente a eritromicina. A técnica MAMA PCR utilizada se constitui em uma ferramenta prática para detecção da resistência à eritromicina em estirpes de C. jejuni e C. coli.(AU)

Caracterización fenotípica de variantes pequeñas de Staphylococcus aureus: un nuevo desafío / Phenotypic characterization of small colony variants of Staphylococcus aureus: a new challenge / Caracterizaçao fenotípica de pequenas variantes de Staphylococcus aureus: um novo desafio

En infecciones crónicas y recurrentes por Staphylococcus aureus se han descripto subpoblaciones de colonias pequeñas (VCPSa). El objetivo de este trabajo fue reconocer las características fenotípicas de VCPSa para optimizar su detección y caracterización a partir de materiales clínicos provenientes de infecciones crónicas. Se analizaron n=3 VCPSa de pacientes adultos con infecciones crónicas de tejidos blandos. Las muestras se inocularon en agar nutritivo, agar sangre, agar chocolate y agar Schaedler suplementado. Se realizaron tinción de Gram, catalasa, coagulasa libre, pruebas de dependencia para hemina, menadiona y timidina y, desarrollo/ataque del manitol en agar manitol salado. La sensibilidad antibiótica se efectuó en agar Mueller Hinton suplementado, según las pruebas de dependencia. Se investigó la presencia de proteína ligadora de penicilina anómala (PBP2´) por aglutinación con látex. Las VCPSa se detectaron en los medios de cultivo enriquecidos. Estas bacterias dieron positivas las pruebas de catalasa y coagulasa, y eran dependientes de menadiona y hemina. En los tres aislamientos se observó resistencia a cefoxitina y se detectó la PBP2´.

In chronic and recurrent infections, small colonies of Staphylococcus aureus subpopulations (SCVSa) have been observed. The objective of the present study was to recognize the phenotypic characteristics of SCVSa isolated from patients with chronic infections to optimize their detection. SCVSa of adult patients n=3 with chronic soft tissue infections were analyzed. Samples were inoculated on nutritive agar, blood-agar, chocolate agar and supplemented Schaedler agar. Subsequently, Gram stain, catalase, free coagulase, dependence tests for hemin, menadione and thymidine, and growth/fermentation of mannitol on salt mannitol agar were performed. Antibiotic susceptibility tests were performed by the agar diffusion method on supplemented Mueller Hinton agar, according to dependence assays results. Anomalous penicillin binding protein (PBP2') was investigated by latex agglutination. SCVSa were detected in all enriched culture media. They showed catalase and coagulase activities, and menadione and hemin dependence. By the agar diffusion test, cefoxitin resistance was found in all isolates; PBP2' was detected as well.

Nas infecções crônicas e recorrentes por Staphylococcus aureus, subpopulações de pequenas colônias (VCPSa) foram descritas. O objetivo desse trabalho foi reconhecer as características fenotípicas de VCPSa para otimizar sua detecção e caracterização a partir de materiais clínicos provenientes de infecções crônicas. Foram analisados n=3 VCPSa de pacientes adultos com infecções crônicas de tecidos moles. As amostras foram inoculadas em agar nutritivo, agar sangue; agar chocolate e agar Schaedler enriquecido. Foram realizados testes de coloração de Gram, catalase, coagulase livre, testes de dependência para hemina, menadiona e timidina, e desenvolvimento/fermentação do manitol em agar manitol salgado. A sensibilidade antibiótica foi realizada em agar Mueller Hinton suplementado, de acordo com os testes de dependência. Foi investigada a presença de proteína ligante de penicilina anômala (PBP2´) por aglutinação com látex. Os VCPSa foram detectados em meios de cultura enriquecidos. Estas bactérias deram positivas nos testes de catalase e coagulase positivos e eram dependentes de menadiona e hemina. A resistência à cefoxitina foi detectada nos três isolados e detectou-se a PBP2'.

Genetic diversity of Gossypium barbadense from the central Brazilian Amazon / Diversidade genética de Gossypium barbadense coletado na Amazônia central

ABSTRACT The Amazon Basin is a center of diversity of Gossypium barbadense and the strategy for conservation of this genetic resource depends on the knowledge of the diversity maintained in Amazonas State. During two expeditions, in 2012 and 2014, plants were collected in ten municipalities in the state of Amazonas, in the central Brazilian Amazon region. The molecular diversity was estimated by SSR markers for 50 samples collected in 2012. The morphological diversity of 24 plants collected in 2014 was assessed ex situ and compared to that of 50 plants of the same and other cotton varieties from other Brazilian states. Most of plants evaluated in situ in Amazonas had purple petioles and veins (82%), associated to medicinal use, and kidney seeds (78%). The ex situ morphological analysies showed that G. barbadense plants from the Amazonas state: i) presented higher similarity to cotton plants from other northern Brazilian states, and ii) were grouped separately from those of other northern Brazilian states by descriptor analysis. Both the molecular (H=0.41) and morphological (H=0.38±0.02) diversity among the collected plants was considered intermediary. Our study indicates the distinctiveness of Amazon cottons, and contributes to demonstrate the discrimination power of multicategorical traits.

RESUMO A bacia Amazônica é um centro de diversidade de Gossypium barbadense e a estratégia de manutenção desse recurso genético depende do conhecimento da diversidade da espécie mantida no Estado do Amazonas. Em 2012 e 2014 plantas desta espécie foram coletadas em dez municípios na região centro-leste do Estado. A diversidade molecular por marcadores microssatélites foi mensurada para 50 amostras da coleta de 2012. A diversidade morfológica de 24 plantas coletadas em 2014 foi medida ex situ e comparada com a de 50 amostras desta e de outras variedades de algodão de outros estados do Brasil. A maioria das plantas do Amazonas apresentou folhas arroxeadas (82%), associadas a uso medicinal, e sementes unidas, do tipo rim-de-boi (78%). A análise morfológica ex situ mostrou que G. barbadense coletado no estado do Amazonas: i) tem maior similaridade com plantas da mesma espécie de outros estados da Região Norte do Brasil e ii) se agrupam entre si de forma diferenciada das plantas de outros estados. A diversidade molecular (H = 0,41) e morfológica (H = 0,38 ± 0,02) entre os acessos foi considerada intermediária. Nosso estudo indica o caráter distintivo dos algodões amazônicos, e contribui para demonstrar o poder de discriminação de variáveis multicategóricas.

Occurrence and diversity of Ralstonia solanacearum populations in Brazil / Ocorrência e diversidade de populações de Ralstonia solanacearum no Brasil

Ralstonia solanacearum is a gram-negative soil-borne bacterium capable of infection of hundreds of vegetable species over more than 50 botanical families, causing bacterial wilt, except for bananas, when the disease is called Moko. It deserves special attention, from all other plant pathogenic bacteria, for its high phenotypic and genotypic plasticity, a characteristic that makes disease control extremely difficult. In this context, frequent and necessary surveys are conduct in the attempt of characterizing the prevailing strains of R. solanacearum in each region where the disease has been reported. However, knowledge about occurrence and diversity of R. solanacearum in Brazil is fragmented and in some cases, based on inconclusive studies with few strains, little representative of a given region. The need to obtain a greater picture guided this review. The occurrence of this bacterium in Brazilian States and the possible causes for its dissemination are presented, with emphasis on studies of genetic variability of populations of R. solanacearum in the country. The compiled results report a wide distribution of the bacterium in Brazil and great variability of its populations among locations. Partly due to the difficulty of detecting small titer of bacteria in samples, paucity of information about the origin of inoculum in certain regions is observed, as well as the need for detecting the presence of the pathogen in asymptomatic plants, potato tubers with latent infections, soil, and water, which are the major causes of bacterial dissemination into areas without any disease history.

Ralstonia solanacearum é uma bactéria gram-negativa habitante do solo capaz de infectar centenas de espécies vegetais distribuídas em mais de 50 famílias botânicas, onde causa a murcha-bacteriana, exceto na bananeira, na qual recebe o nome de Moko. Destaca-se entre outras bactérias fitopatogênicas pela sua alta plasticidade fenotípica e genotípica, característica que contribui sobremaneira para dificultar o controle da doença. Nesse contexto, levantamentos frequentes e necessários são conduzidos na tentativa de caracterizar isolados de R. solanacearum prevalentes em cada região onde a doença tem sido relatada. No Brasil, o conhecimento sobre a ocorrência e a variabilidade de R. solanacearum está fragmentado e, em alguns casos, baseado em estudos inconclusivos pelo uso de amostras de isolados pouco representativas de uma região. A necessidade de agrupar essas informações norteou a presente revisão de literatura. A ocorrência da bactéria nos Estados brasileiros e as possíveis causas de sua disseminação são apresentadas, com ênfase nos estudos da variabilidade genética das populações de R. solanacearum no país de acordo com o atual esquema de classificação da bactéria. Os resultados de pesquisa compilados da literatura reportam ampla distribuição da bactéria no Brasil e grande variabilidade de suas populações entre locais. Em parte devido à dificuldade de detectar pequenos números de células bacterianas em amostras, nota-se escassez de informações sobre a origem do inóculo em determinadas regiões, bem como a necessidade de detectar a presença do patógeno em plantas assintomáticas, em tubérculos de batata com infecções latentes, no solo e na água, que são as principais causas da disseminação da bactéria para áreas sem histórico da doença.

Isolation and characterization of lactic acid bacteria and yeasts from the Brazilian grape sourdough

Sourdough is a mixture of flour and water fermented by lactic acid bacteria and yeast, with a large use in bakery products. This study was developed with Brazilian grape (Niagara rosada) sourdough obtained from spontaneous fermentation. The aim of this work was to characterize genotypic and phenotypically lactic acid bacteria and yeasts isolated from sourdough. The phenotypic identification for bacteria and yeasts was performed by using the kit API50CHL and 20CAUX and the genotypic characterization was performed by sequencing method. A total of four isolated strains were analyzed in this study. Two of these strains were phenotypically and genotypic identified as Lactobacillus paracasei and one as Saccharomyces cerevisiae. Another sample phenotypically identified as Candida pelliculosa did not show the same identity by sequencing. It shows the need to use phenotypic and genotypic characterization associated for the correct microorganism identification.

Fermento natural é mistura de farinha e água fermentada por bactérias láticas e leveduras, amplamente utilizada em produtos de panificação. Neste estudo desenvolveu-se um fermento natural de uva brasileira (Niagara rosada), obtido a partir de fermentação espontânea. O objetivo deste trabalho foi caracterizar fenotipicamente e genotipicamente bactérias láticas e leveduras isoladas do fermento natural de uva. A identificação fenotípica para bactéria lática e leveduras foi realizada usando os kits API50CHL e 20CAUX e a caracterização genotípica foi realizada pelo método de sequenciamento. Neste estudo, isolaram-se quatro cepas. Duas cepas foram identificadas fenotipicamente e genotipicamente como Lactobacillus paracasei e outra cepa como Saccharomyces cerevisiae. A outra amostra de levedura, identificada fenotipicamente como Candida pelliculosa, não obteve a mesma identidade com a técnica de sequenciamento. Isso mostra a necessidade do uso da caracterização fenotípica e genotípica em associação para a correta identificação do micro-organismo.

Determinação da resistência de Staphylococcus aureus: um desafio? / Identification of drug resistance in Staphylococcus aureus: a challenge?

O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de resistência de cepas de Staphylococcus aureus, com diferentes padrões de eletroforese em campo pulsado (PFGE), em relação à resistência induzida à clindamicina e caracterizar cepas resistentes à oxacilina por testes fenotípicos. Do total de 18 cepas diferenciadas por PFGE, isoladas dos sítios nasais ou linguais de portadores adultos saudáveis, sem doença de base, sem histórico de uso de antibióticos e internações hospitalares, quatro (22,2%) apresentaram sensibilidade à clindamicina no antibiograma convencional, mas demonstraram resistência no D-teste; uma cepa (5,6%) foi caracterizada como BORSA (borderline) em relação à resistência a oxacilina e outra (5,6%) CA MRSA (S.aureus meticilina/oxacilina resistente associado à comunidade), ambas sensíveis à cefoxitina pelo teste de disco difusão. A caracterização molecular pela reação em cadeia para polimerase (PCR) da cepa identificada fenotipicamente como CA MRSA não revelou a presença do gene mecA, indicando tratar-se de cepa BORSA. Estes resultados apontam a importância do emprego rotineiro do D-teste como ferramenta para a determinação da resistência do tipo induzida à clindamicina, bem como para a importância da inclusão do teste de resistência à cefoxitina entre os métodos fenotípicos para caracterização de MRSA.

The aim of this study was to identify the resistance profile of Staphylococcus aureus strains, in relation to induced clindamycin resistance, and to detect oxacillin resistance by the routine phenotypic methods. The strains were isolated from nasal or lingual swabs taken from healthy adult carriers with no medical history of hospitalization or antibiotic treatment. Eighteen strains were distinguished by the different patterns generated by pulsed gel electrophoresis (PFGE). Four (22.2%) of these showed sensitivity to clindamycin by the conventional antibacterial susceptibility test, but demonstrated inducible resistance to it by the D-test. One strain (5.6%) was characterized as borderline oxacillin-resistant S. aureus (BORSA), and another (5.6%) as CA MRSA (community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus). Both of these strains were shown to be cefoxitin susceptible by the disk diffusion test. The polymerase chain reaction (PCR) failed to detect the mecA gene in this last strain and it was thus classified as BORSA. These results show the importance of incorporating the D-test into the routine lab tests for S. aureus inducible clindamycin resistance and also of including the cefoxitin resistance test among the phenotypic methods for MRSA characterization.